作者前期的研究表明，HFD（高脂饲养）小鼠肺组织中ACOD1的mRNA水平显著低于NCD小鼠（正常饮食）；为了在临床样本中验证这一结果，作者收集了正常体重与肥胖患者的肺组织样本，结果显示肥胖患者肺组织中的ACOD1 mRNA水平显著低于正常体重组。WB和免疫荧光结果与上述结果一致。此外，ACOD1的代谢产物衣康酸（itaconate）水平在肥胖患者肺组织中的含量也显著低于正常体重组。而且，ACOD1的表达水平与体重指数（BMI）、血脂及血糖水平呈负相关。

为了明确肥胖对ACOD1表达的影响，作者通过16周HFD建立小鼠肥胖模型。与NCD组相比，HFD小鼠体重显著增加、血脂水平升高、空腹血糖水平上升且糖耐量受损，而且HFD小鼠心、肺、肝、肾等器官的脂质沉积较NCD组更显著；与临床样本结果一致，HFD小鼠肺组织中ACOD1的mRNA、蛋白水平及衣康酸浓度均显著低于NCD组。

已有研究表明，ACOD1的表达在炎症期间显著上调，为了探讨ACOD1在肥胖背景下LPS诱导的ALI中的作用，作者通过气管内注射LPS建立小鼠ALI模型。结果表明，LPS暴露导致大量病理损伤，包括肺泡结构破坏，肺泡壁增厚，炎症细胞浸润增加以及气道阻力显著增加和肺顺应性降低。与NCD小鼠相比，HFD小鼠出现更严重的肺功能障碍。并且，肺组织病理改变在HFD小鼠中比NCD小鼠更为严重。此外，支气管肺泡灌洗液（BALF）和血清中的炎性细胞因子水平进一步证实了LPS暴露诱导的炎症加剧（LPS暴露后，BALF和血清中促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平均显著上升，而抗炎因子IL-10水平下降）。与正常饮食小鼠相比，高脂饮食小鼠促炎细胞因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）的升高更为明显，而IL - 10的升高相对较小。总之，LPS暴露诱导了显著的肺功能障碍、组织损伤、炎症和氧化应激，且与NCD小鼠相比，这些影响在HFD小鼠中更为严重。

为了确定ACOD1在肺部的特异性作用（而非全身效应），作者通过气道注射腺相关病毒（AAV），特异性敲低小鼠肺部ACOD1的表达。感染四周后，肺部ACOD1的mRNA和蛋白水平显著降低。与对照小鼠比较，LPS暴露组在ACOD1敲低后肺功能损伤更严重，组织损伤加剧，BALF总蛋白含量、肺湿重/干重比（W/D）和乳酸脱氢酶（LDH）活性升高。此外，肺部ACOD1敲低明显加剧了LPS诱导的炎症和氧化应激。这些结果表明，ACOD1在缓解LPS诱导的炎症和氧化应激中发挥关键作用。

接着，为了逆转肥胖导致的ACOD1的下调，作者通过气道注射AAV使HFD小鼠肺部ACOD1特异性高表达。感染四周后，HFD小鼠肺组织ACOD1表达显著升高。在LPS诱导的ALI模型中，肺部ACOD1过表达减轻了LPS诱导的肺功能障碍和组织损伤（气道阻力降低、肺顺应性恢复、肺泡结构破坏和炎性细胞浸润减轻），降低了BALF总蛋白含量、W/D比和LDH活性。同时，肺部ACOD1过表达显著减轻了LPS诱导的炎症和氧化应激。进一步为了验证ACOD1通过其代谢产物衣康酸发挥作用，作者对HFD小鼠进行腹腔注射衣康酸衍生物4-OI，研究结果显示，外源性衣康酸补充可部分改善HFD小鼠在LPS暴露后的肺功能、减轻肺损伤并降低炎症和氧化应激水平。综上，气道靶向过表达ACOD1及其下游代谢产物衣康酸对HFD小鼠LPS诱导的肺损伤具有显著保护作用。 

已有研究表明，ACOD1主要在免疫细胞（尤其是巨噬细胞）中表达，为了确定ACOD1在肺组织的细胞定位及其作用机制，作者检测了人和小鼠肺组织中ACOD1的定位，结果显示，ACOD1主要定位于肺巨噬细胞；接着，作者检测了人和小鼠BALF中巨噬细胞ACOD1的表达，结果显示，肥胖个体及HFD小鼠的ACOD1表达显著低于对照组。

尽管已知肺泡巨噬细胞参与ALI病理过程，但其在ACOD1介导的肥胖加重ALI保护中的作用尚未明确。因此，作者通过气道注射氯膦酸脂质体（CLs）特异性耗竭肺泡巨噬细胞。结果显示，在巨噬细胞耗竭的HFD小鼠中，过表达ACOD1改善肺功能、减轻组织损伤等保护效应均显著消失。此外，炎症因子及氧化应激标志物的变化也没有组间差异。另外，鉴于中性粒细胞在ALI中的作用，作者通过气道注射抗Ly6G抗体耗竭肺中性粒细胞，结果显示，中性粒细胞耗竭后，过表达ACOD1仍可显著改善HFD小鼠的肺损伤。由此表明ACOD1的保护作用依赖于肺泡巨噬细胞而非中性粒细胞。

为了进一步研究ACOD1在LPS诱导的肺泡巨噬细胞炎症和氧化应激中的作用，作者利用慢病毒构建了稳定敲低ACOD1的小鼠肺泡巨噬细胞（MH-s）细胞系（ACOD1的mRNA和蛋白水平显著低于对照细胞）。在LPS暴露后，正常细胞和ACOD1敲低细胞中M1巨噬细胞标志物iNOS和CD86的mRNA 水平显著上调，同时M2巨噬细胞标志物Arg-1和CD206的mRNA水平显著下调。并且，M1/M2极化失衡在ACOD1敲低细胞中进一步加剧，即M1标志物的表达更高，M2标志物的表达进一步受到抑制。同时，作者利用流式细胞术测定了各组细胞中M1型巨噬细胞和M2型巨噬细胞的比例，与上述结果一致，在LPS暴露后，正常细胞和ACOD1敲低细胞中M1巨噬细胞显著增加，M2型巨噬细胞显著减少。综合分析表明，LPS暴露上调了巨噬细胞中M1极化标志物（iNOS和CD86）的表达，同时下调了M2极化标志物（Arg-1和CD206）的表达。值得注意的是，敲低ACOD1进一步加剧了这种LPS诱导的M1/M2极化转变。另外，LPS暴露显著增加了巨噬细胞中的促炎细胞因子（IL-6、IL-1β、TNF-α）和抗炎细胞因子IL-10的水平，以及ROS和MDA水平升高，抗氧化酶活性（SOD、CAT、GSH）降低。与正常细胞比较，ACOD1敲低细胞中促炎细胞因子进一步升高，而IL-10水平较对照组LPS暴露的细胞更低，表明促炎反应增强和抗炎反应减弱。并且，ACOD1敲低细胞中氧化应激也加剧，ROS和MDA水平更高，抗氧化酶活性进一步降低；总之，这些结果表明ACOD1缺乏会加剧LPS诱导的巨噬细胞炎症和氧化应激。

为了在体外模拟高脂环境，作者将MH-s细胞与由3T3-L1前脂肪细胞分化而来的脂肪细胞进行共培养，结果显示MH-s细胞中ACOD1表达显著降低。LPS刺激后，MH-s细胞中的ACOD1水平显著升高，但共培养组中的ACOD1水平仍低于对照组。接着，作者利用慢病毒构建了稳定过表达ACOD1的MH-s细胞，并证实ACOD1的mRNA和蛋白水平显著增加。将ACOD1过表达的细胞和对照细胞分别与脂肪细胞共培养，随后在相同条件下进行LPS暴露。研究结果显示，在高脂环境中，LPS显著上调M1巨噬细胞标记物的表达，并下调M2标记物的表达，由此表明高脂环境中的巨噬细胞容易受到LPS诱导而发生促炎性极化。而与脂肪细胞共培养的过表达ACOD1的细胞中，这种极化转变得到了显著缓解，mRNA水平上M1型标志物上调和M2型标志物下调的现象出现逆转。并且，进一步流式细胞术、免疫荧光和免疫印迹分析也证实了这些结果。另外，在高脂环境中，LPS暴露显著加重了MH-s细胞的炎症和氧化应激反应水平升高，同时抗氧化酶活性下降；而在MH-s细胞中过表达ACOD1，可以减轻由LPS诱导的炎症和氧化应激；之后，作者在MH-s细胞与脂肪细胞的共培养体系中加入4-OI并用LPS刺激，结果发现M1型巨噬细胞比例降低，M2型巨噬细胞比例增加，并且LPS诱导的炎症和氧化应激显著减轻。这些研究结果表明，在体外高脂环境中，ACOD1在肺泡巨噬细胞中的表达减少。然而，过表达ACOD1和外源性衣康酸补充能有效缓解LPS诱导的巨噬细胞炎症和氧化应激。

为了探究ACOD1在体内肺巨噬细胞中的功能，作者通过气管内注射带有F4/80巨噬细胞特异性启动子的AAV特异性敲低小鼠肺巨噬细胞中的ACOD1。AAV感染4周后，与对照组比较，敲低组肺巨噬细胞中ACOD1的表达显著降低，此外，敲低组小鼠BALF中的肺泡巨噬细胞中的ACOD1的表达也显著低于对照组。LPS暴露后，小鼠观察到明显的ALI特征，并且，与对照组比较，敲低组小鼠在LPS暴露后表现出更严重的肺功能恶化（包括气道抵抗增加、肺顺应性降低）以及肺组织损伤加重，并伴随着BALF总蛋白水平升高，W/D增加，LDH水平升高。此外，作者分析了BALF和血清中炎性细胞因子以及氧化应激标志物的水平，研究结果显示，肺巨噬细胞ACOD1敲低会加剧LPS引起的炎症和氧化应激。

接着，作者通过气管内注射带有F4/80特异性启动子的AAV在小鼠肺巨噬细胞中特异性过表达ACOD1。研究结果显示，与对照组比较，ACOD1过表达组在LPS暴露后肺功能恶化程度下降，以及肺损伤程度、炎症反应和氧化应激水平都有显著改善。综上所述，通过体内实验验证了ACOD1在肥胖相关ALI中发挥关键保护作用。

Nrf2被广泛认为是ACOD1的下游靶点，在介导抗炎和抗氧化反应中发挥关键作用。为了阐明ACOD1在肥胖加重ALI背景下的下游机制，作者评估了NCD和HFD小鼠中的Nrf2表达水平。HFD小鼠肺组织中Nrf2的表达低于正常小鼠，LPS暴露后，两组小鼠的肺组织中Nrf2均显著升高；并且，肺巨噬细胞ACOD1敲低的NCD小鼠肺组织中Nrf2的mRNA和蛋白水平显著低于正常NCD小鼠，相反，肺巨噬细胞ACOD1过表达的HFD小鼠中Nfr2水平显著高于HFD小鼠，在细胞实验中也观察到类似的趋势。这些结果表明，巨噬细胞中的ACOD1正向调节Nrf2的表达，并且肥胖加重ALI可能与巨噬细胞特异性ACOD1下调导致的Nrf2水平降低和抗炎及抗氧化反应受损有关。为了进一步研究Nrf2是否是 ACOD1在肥胖加重ALI中保护作用的关键下游介质，作者进行了体内外实验。体内实验中，作者通过腹腔注射Nrf2抑制剂ML385，结果显示，与未使用抑制剂的对照组比较，Nrf2抑制显著减弱了巨噬细胞靶向ACOD1过表达对肺损伤的保护作用（表现为肺功能恶化、病理损伤加重、BALF蛋白含量增加、W/D比值升高、LDH 活性增强以及炎症和氧化应激加剧）。在体外实验中，作者观察到类似的趋势。在高脂条件下培养的 ACOD1过表达的MH-s细胞中， Nrf2的抑制显著减弱了ACOD1过表达对LPS诱导的炎症和氧化应激的有益作用。这些结果表明，Nrf2是ACOD1在肥胖加重ALI中保护作用的关键下游介质。巨噬细胞中的ACOD1通过上调Nrf2表达来减轻LPS诱导的炎症和氧化应激，从而保护肺组织免受损伤。

为了研究肥胖背景下ACOD1下调的机制，作者重点关注了调控ACOD1表达的转录因子。作者通过筛选确定了与 ACOD1关联最强的八个转录因子：JUND、JUN、STAT5a、STAT5b、PRDM1、LHY3、GFI1和PAX7，评估了这些转录因子在NCD和HFD 小鼠肺组织中的mRNA和蛋白水平。研究结果显示，只有GFI1蛋白水平在HFD小鼠的肺组织中显著升高。并且，与对照组相比，HFD小鼠中GFI1的表达更高，在LPS暴露后其核转位更为显著。这些结果表明，转录抑制因子GFI1在肥胖中上调，并可能抑制肺组织中ACOD1的转录。接着，作者进行了染色质免疫共沉淀（ChIP）和双荧光素酶报告实验，验证了GFI1和ACOD1的转录调控关系。

为了进一步阐明GFI1在肥胖背景下调控肺ACOD1表达的作用，作者通过气道注射AAV实现在HFD小鼠的肺组织中特异性敲低GFI1，LPS暴露后，对GFI1敲低的HFD 小鼠的肺功能、损伤、炎症和氧化应激进行评估。结果显示，GFI1敲低显著增加了肺组织中ACOD1及其下游靶点 Nrf2的表达，并部分改善了LPS诱导的肺功能障碍，减轻了肺损伤，减少了炎症，并缓解了氧化应激。总之，这些结果表明，GFI1在肥胖背景下抑制了肺组织中ACOD1的转录，加剧了LPS诱导的肺损伤、炎症和氧化应激。敲低肺组织中的GFI1可恢复肺组织中ACOD1的表达，并部分缓解了肥胖中 LPS 诱导的肺损伤的加重。

综上，本研究表明，在肥胖状态下肺泡巨噬细胞中GFI1表达升高从而抑制了ACOD1的表达，这种抑制作用加剧了LPS暴露后的炎症反应和氧化应激，导致肥胖个体发生更严重的肺损伤。本研究强调了ACOD1在减轻肥胖加重急性肺损伤中的关键保护作用，为应对肥胖人群中更严重的急性肺损伤提供了潜在的治疗策略。