首先制备PDA NPs修饰的水凝胶，将单体多巴胺基团引入HA链（HA-DA）来增强粘附性能，后续可通过氢核磁共振（HNMR）和FTIR光谱检查产物。HNMR显示多巴胺很好地结合到了HA链，FTIR光谱显示在多巴胺接枝过程中形成了酰胺键。这些结果表明HA-DA含有苯环和亚甲基结构。PDA NPs通过多巴胺的氧化自聚合合成。将PDA NPs和HA-DA溶液混合，在37°C下用NaIO4交联5分钟制备PDA NPs修饰的水凝胶。检测水凝胶的微观结构，发现合成的水凝胶具有均匀且相互连接的多孔网络特征，以及明显的PDA NPs掺入。使用流变仪评估储存模量（G'）和损耗模量（G''）研究水凝胶的机械性能和稳定性，结果表明其具有稳定的粘弹性。此外，HA-DA水凝胶的G'通过添加PDA NPs和hMSCs显著增加，接近天然脊髓组织的G'。HA-DA水凝胶可以紧密粘附在小鼠脊髓组织上，并且与HA水凝胶相比，粘附力显著增加，表明多巴胺改性后粘附性得到了改善。

作者接着评估了H-P-M水凝胶对hMSCs的细胞毒性。通过流式细胞术分析，人脐带间充质干细胞（hUC-MSCs）中表面标记物CD73、CD90和CD105的阳性率分别为99.93%、99.98%和99.98%，而造血干细胞标记物CD34和CD45未检出。随后，检测了hUC-MSCs的成骨、成脂和成软骨分化潜力，hUC-MSCs表现出三系分化能力。为了研究PDA NPs浓度对水凝胶生物相容性的影响，将hUC-MSCs暴露于不同浓度的PDA NPs（0、10、20和50 μg/ml）中。CCK8检测发现在50 μg/ml浓度下活细胞减少，说明高浓度的PDA NPs对细胞增殖有负面影响。

为了进一步研究H-P-M水凝胶在体内的毒性，将其注射到小鼠脊髓组织中。8周后，收集血液检查以评估肝肾功能，未观察到肝肾功能损害指标的显著升高。此外，心脏、肾脏、肝脏、肺和脾脏中均未观察到病理变化，表明H-P-M水凝胶对这些器官没有毒性。

ROS的积累会加剧神经功能缺损，阻碍运动功能的恢复。为了验证水凝胶清除ROS的能力，用LPS处理培养在不同浓度PDA NPs中的BV2细胞。结果显示，与对照组相比，10、20和50 μg/ml的PDA NPs处理显著降低了细胞内ROS水平。此外，激活的BV2细胞中炎症因子IL-6和IL-1β的mRNA水平在PDA NPs处理后降低。结果表明PDA NPs在20 μg/ml的最佳浓度下有效清除细胞内ROS并降低体外促炎因子的水平。接下来评估共培养的原代NSPCs和水凝胶负载的hMSCs的神经元分化，H-P-M组中神经元细胞标志物Tuj1/MAP2的表达显著增加，而星形胶质细胞的标志物GFAP表达降低，表明神经元分化增强。综上所述，这些结果表明，H-P-M水凝胶在体外促进NSPCs的神经元分化。

为了研究H-P-M水凝胶在体内的治疗效果，作者在手术后立即将水凝胶注射到病变部位。H-P-M水凝胶治疗8周后，HE染色显示病变面积显著减少，并且在H-P-M水凝胶组中观察到5-HT轴突再生穿过病变部位，而在SCI组（对照组，未注射水凝胶）中未观察到这种再生。随后，作者进行了动物行为学和电生理测试以评估治疗后的功能恢复。使用BMS评分（专用于小鼠后肢功能的评分方法）和步态分析评估H-P-M水凝胶治疗后SCI小鼠的运动功能恢复。与SCI组相比，H-P-M水凝胶治疗的SCI小鼠的BMS评分显著改善，并且H-P-M水凝胶组的运动诱发电位（MEP，一种电生理监测装置）振幅相对于其他治疗组显著改善。与后肢运动缺失的SCI组相比，H-P-M水凝胶治疗的小鼠表现出优越的后肢运动。总之，这些结果表明应用H-P-M水凝胶有效增强了SCI后的运动功能恢复。

为了探寻H-P-M水凝胶在SCI后运动功能恢复的机制，作者取H-P-M水凝胶治疗组的小鼠脊髓组织进行RNA-seq测序。发现了9160个差异表达基因（DEGs），而在上调的DEGs中发现了显著富集的生物过程（BPs），包括突触组织、神经递质运输和突触可塑性调节，表明神经发生和突触活性增强。此外，热图显示神经元标记物（Tubb3、Map2、NeuN）、运动神经元标记物（Chat）和突触小泡标记物（Syp、Snap25）显著上调，表明神经发生和神经元活性增强。

eNSPCs的不足会加剧神经功能缺损，阻碍运动功能的恢复。为了研究H-P-M水凝胶对eNSPCs招募和分化的影响，作者利用Nestin谱系示踪小鼠对损伤脊髓中的eNSPCs进行了追踪，用tdTomato标记eNSPCs，发现eNSPCs中有86%的细胞Ki67+（绿色）呈阳性。与SCI组相比，H-P-M组在损伤中心观察到更多eNSPCs积累，表明H-P-M水凝胶对招募eNSPCs有显著效果。随后，作者进行了免疫荧光染色以研究eNSPCs在损伤中心的分化情况。tdTomato阳性的eNSPCs与神经元标记物Tuj1和突触前标记物Syn1共定位，表明招募的eNSPCs有潜力分化为功能性神经元并整合到损伤脊髓的神经回路中。

KEGG富集分析表明，H-P-M水凝胶主要通过正向调节MAPK级联信号通路促进eNSPCs神经元分化（图6）。所以作者分析了MAPK通路中的家族蛋白，包括ERK、JNK、p-ERK和p-JNK，H-P-M水凝胶组中p-ERK和p-JNK都有所增加，表明H-P-M水凝胶促进了eNSPCs神经元分化。

GO和GSEA结果显示免疫细胞迁移、炎症反应和细胞因子下调，特别是炎症因子iNOS、IL-1β和IL-6显著下调，表明H-P-M水凝胶注射后炎症反应减少。IBAL+（绿色）的小胶质细胞中，促炎因子iNOS（红色）表达减少，而抗炎因子Arg1（红色）增加，表明H-P-M水凝胶组中炎症反应减轻。这些发现表明，H-P-M水凝胶有效抑制了继发性炎症反应，并促进了eNSPCs的神经元分化，这归因于PDA NPs的抗氧化和抗炎特性，有助于轴突再生和运动功能恢复。

近年来的研究数据表明，结合神经营养因子的生物活性材料展现了触发神经元再生的潜力。而在细胞移植中，MSCs目前被认为是基于干细胞治疗SCI的最佳选择。本研究中作者开发了一种多功能水凝胶（H-P-M水凝胶），以触发和维持移植细胞的功效，具有ROS清除、低免疫原性和抗炎作用。本研究利用了多种功能的协同作用，设计了一个有利于eNSPCs神经元分化的生态位，从而有助于重建损伤脊髓中的神经回路。