PART 01

PART 02

BD Horizon Brilliant™ (Sirigen™)

BD Horizon RealBlue™ 和RealYellow™

PART 03

PART 04

使用来源于健康贡献者并经过固定和冷冻保存的外周血，作者对细胞组分进行了染色处理。在这套流式门控策略中，作者首先引入了时间门控，排除在采样过程中可能存在的不稳定性对结果的影响。经过FSC-A和 FSC-H门控排除非单细胞信号（双细胞或成团细胞），圈出CD45⁺白细胞，并联合使用 SSC-A、FSC-A、CD14和CD33排除细胞聚集和抗体聚集的情况，进一步保证样本单细胞质量。作者根据CD66表达初步圈出 CD66⁺ 粒细胞和CD66^- 的髓系和淋巴系细胞。

根据髓系品系标记物CD33表达可以将 CD66^-细胞群分成CD33⁺髓系细胞和 CD33^-非髓系细胞。在CD33⁺髓系细胞中，排除CD3⁺T细胞、CD19⁺B细胞和 CD56⁺NK细胞，只保留HLA-DR⁺细胞。根据CD14、CD16和CD11c表面标记物的表达，能够从HLA-DR⁺细胞群中分出 CD14⁺CD16^-经典单核细胞、CD14⁺CD16^+/low中间态单核细胞、CD14^-CD16⁺非经典单核细胞、CD14^-CD16^-CD11c⁺髓系树突状细胞。同时，作者鉴定到了CD33⁺髓系细胞基本全部表达CD32和CD38。

在CD33^-的淋巴系细胞中，根据T细胞标记物CD3初步分成CD3^-非T细胞和CD3⁺T细胞。根据多种细胞类型经典表面标记物的表达，在CD3^-非T细胞群中分别圈出CD4^-CD56^-CD19⁺B细胞、CD4^-CD19^-CD56^dim/brightCD16^+/-NK细胞和CD4^-CD19^-CD56^-CD16^-CD127⁺固有淋巴细胞（ILCs）。

作者进一步对B细胞和NK细胞的活化状态等免疫特征进行分析。IgD和CD27的表达能够区分B细胞的活化状态：初始B细胞特征为IgD⁺CD27^-，记忆B细胞特征为IgD^-CD27⁺。穿孔素perforin与颗粒酶B、CD57与CD27的两个组合分别表征了NK细胞的细胞毒性和记忆活化状态。

在前文排除CD33⁺髓系细胞、B细胞和NK 细胞后，在余下CD3⁺T细胞中，首先根据γδTCR和Vδ2的表达圈出了γδTCR⁺γδT细胞。在γδ TCR^- 细胞中，根据TRAV1.2、CD161的表达能够圈出TRAV1.2⁺CD161⁺ 黏膜相关恒定T细胞（MAIT）细胞。根据CD56的表达将余下细胞分成CD56⁺类 NKT 细胞与CD56^-传统T细胞。

传统CD3⁺CD56^-T细胞包含多个亚群：CD4⁺CD8^-T细胞、CD4^-CD8⁺T细胞和 CD4⁺CD8⁺T细胞。CCR7和CD45RA通常用来评估T细胞活化状态，将CD4⁺或 CD8⁺T细胞分成CCR7⁺CD45RA⁺初始T细胞、CCR7⁺CD45RA^-中央记忆T细胞、CCR7^-CD45RA^-效应记忆T细胞和CCR7^-CD45RA⁺终末分化T细胞。同样CD57、CD27的表达也能用于评估记忆分化状态。

另外，作者还在这套门控策略中引入了能够表征细胞增殖能力、细胞毒性、活化状态的标记物：Ki67、穿孔素和颗粒酶B、HLA-DR和CD38，对T细胞更多状态进行系统评估。

PART 05