CHO细胞是生产重组治疗性蛋白 (RPTs) 的首选宿主细胞，然而，在CHO细胞RTPs的开发过程中，蛋白质降解是一个常见问题，不仅降低了产量，还可能影响蛋白质的稳定性和功效，从而对药物疗效和经济效益产生负面影响。本文根据最新研究进展，探讨CHO细胞中表达蛋白的降解原因以及可以采取的上游工艺调控策略。
重组蛋白降解的机理
在CHO细胞培养过程中，重组蛋白可能通过以下2种途径降解：
胞外降解：培养液中的蛋白酶可以直接作用于分泌出来的重组蛋白，导致其分解；培养环境中的温度、pH值、氧气浓度等影响蛋白质的稳定性。
胞内降解：主要是酶系统，主要包括蛋白酶和溶酶体酶，它们可以分解蛋白质，导致其失去活性。
影响因素
特定蛋白的固有不稳定性
有些蛋白质由于其自身的结构特点，比如易于聚集或对温度和pH值敏感，而更容易降解。
载体构建阶段使用的表达载体和启动子的类型会影响蛋白表达速度和折叠效率。
培养条件和细胞代谢
温度、pH值和营养物质供给不当可能导致蛋白折叠不正确，从而加速降解。
细胞代谢状态：高细胞密度和代谢废物积累会增加蛋白降解。
易降解蛋白的表达策略
针对上述蛋白降解的途径和影响因素，可在工艺开发中考虑以下几点策略：
优化细胞培养条件：
初步研究表明，通过调整培养参数，如提高pH值或降低温度，可以减少蛋白降解。pH值的变化会影响RTPs的滴度和质量，包括N-糖基化、蛋白质聚集和电荷变化[1]。降温是RTPs细胞培养工艺中常用的调控策略，有研究表明，将培养温度从37°C降低到30°C可以有效减少蛋白质降解，培养温度的降低会影响N-糖基化，改变内质网中蛋白质的折叠和加工，从而影响RTPs的降解，增强CHO细胞中嵌合融合蛋白的产生。其他通过调控培养工艺来控制蛋白降解的方法可参考表1。
表1：CHO细胞RTP降解的培养工艺策略
使用培养基添加剂：
在细胞培养基方面，控制氨基酸水平，使用细胞培养添加剂等也可以减少蛋白降解。比如添加特定比例的酪氨酸和半胱氨酸可减轻内质网应激，提高产量。另外加入抗氧化剂和折叠助剂能增强蛋白稳定性。具体可参考表2 CHO细胞中RTP降解的培养基添加策略。
表2：CHO细胞中rtp降解的培养基添加策略
采用连续灌流工艺：
如图1所示，灌流培养模式下的剪切程度较低且稳定，能有效减少剪切力，变化范围在0.6%到1.5%之间。灌流聚体水平明显低于流加批次 (fed-batch) 培养模式，且主要电荷变体主峰值更高更稳定。这表明灌流培养能够更有效地控制蛋白的稳定性和一致性。
图1：不同培养模式下 (Perfusion -PF, Fed-batch high seeding-HS, Fed-batch low seeding-LS) 剪切 (A) 、聚合体 (B) 和电荷变体 (c) 情况
工程化载体设计和基因编辑技术：
利用具有更强启动子和增强子的载体，优化转录和翻译过程，以及通过CRISPR/Cas9等技术敲除或过表达某些关键基因，都增强CHO细胞的蛋白生产能力。
图2：CHO细胞中重组治疗性蛋白降解的影响因素及主要克服策略[1]
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参考文献
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2025-09-07
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