为了保证药品的质量可控性，需要有基于“QbD”的质量标准及对应的分析检测方法，然而在应用拟定的分析方法进行定量分析中，检测结果出现偏差，经过一系列的偏差调查发现原因没找到的时候，需要排查的一个重要因素是定量方法。
一、 定量方法的概述
内标法：首先计算校正因子，根据校正因子计算供试品的量，具体公式如下：
外标法：包括外标一点法，自身对照法（加校正因子和不加校正因子），其中外标一点法采用对照品和供试品的峰面积和浓度进行含量的计算，公式如下：
通常校正因子在0.9-1.1之间或者无法获得校正因子时直接应用自身对照法进行杂质限量计算，如果校正因子不在规定范围内，需要增加校正因子进行计算，校正因子的公式如下：
标准曲线法：先计算浓度范围内的标准曲线，然后根据供试品的响应值带入标准曲线中计算供试品的量，公式如下：
面积归一化法：测量各峰和色谱图上除溶剂峰以外的总色谱峰面积，计算各峰面积占总峰面积的百分率。
标准溶液加入法：配制适当浓度的对照品溶液加入供试品溶液中，然后利用外标或内标法计算待测成分的含量，公式如下：
二、“测不准”的案例
案例一：HPLC-ELSD方法中外标一点法计算的含量不准。
信息1：SD1、SD2、SD3的浓度分别为：0.01263mg/ml、0.02526mg/ml、0.030312 mg/ml；对应的峰面积A1、A2、A3分别为：2834.148、7633.898、9129.124；
信息2：供试品进样分析后的峰面积AX为6009.84；
结果1：以C（mg/ml）为横坐标，A为纵坐标线性回归：y=360629.12x-1666.15，以对照浓度0.02526mg/ml进行外标一点法定量计算Cx=0.01989mg/ml；
结果2：以lgC为横坐标，lgA为纵坐标线性回归：y=1.361x+6.041，以标准曲线法将lgAX带入线性方程后计算Cx=0.02177mg/ml；
讨论：Cx=0.01989mg/ml与Cx=0.02177mg/ml相比，差了约8%。
ELSD是通用型检测器，适用于无需具有光吸收特性的物质，如磷脂、糖类等物质的测定。ELSD的检测原理是待测物随着流动相进入雾化室内，被雾化成小液滴，被载气带入漂移管内，流动相被蒸发，待测物以溶质颗粒的状态发生光散射，然后以光电倍增或光电二极管转换信号进行检测。在ELSD的方法中通常应用对数相关的方式进行线性回归，因为在ELSD的检测过程中随着浓度的增加，信号响应的方差可能会随之增大，为了使方差恒定，可以采用浓度和峰面积取对数后的线性回归，并且在实际供试品含量计算时需要带入线性方程进行计算，在ELSD的方法中不宜采用单点外标，至少两点一线的曲线法进行定量计算。
案例二：离子色谱法检测某阴离子时应用外标一点法计算回收率不合格。
信息1：SD1、SD2、SD3、SD4、SD5、SD6、SD7的浓度分别为：3.2330μg/ml、5.1728μg/ml、6.4660μg/ml、7.7592μg/ml、9.6990μg/ml、12.9320μg/ml、16.1650μg/ml；对应的峰面积A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7分别为：0.2658、0.4186、0.5156、0.6082、0.7483、0.9742、1.1803；
信息2：供试品进样分析后的峰面积A本底为0.5018；回收率试验中峰面积A低为0.878；回收率试验中峰面积A中为0.958；回收率试验中峰面积A高为1.042；
信息3：回收率的可接受标准为95%-102%；
结果1：以外标一点法计算，对照浓度6.4660μg/ml，峰面积0.5156；计算得本底浓度6.2929μg/ml；回收率试验中低91.2%、中88.5%、高87.3%，回收率均不符合要求；
结果2：以标准曲线法计算，以C（μg/ml）为横坐标，A为纵坐标线性回归：y=0.070x+0.053；计算得本底浓度6.4114μg/ml；回收率试验中低96.2%、中99.2%、高100.5%，回收率均不符合要求；
讨论：在离子色谱法中标准曲线法的准确度符合要求，离子色谱中电导检测器，灵敏度较高，容易受到离子干扰，在定量计算中不适宜选择外标一点法。
案例三：GC法检测API中的残留溶剂时应用外标一点法计算回收率不合格。
信息1：SD1、SD2、SD3、SD4、SD5的浓度分别为：25.05μg/ml、40.08μg/ml、50.10μg/ml、60.12μg/ml、75.15μg/ml；对应的峰面积A1、A2、A3、A4、A5分别为：53.18、85.62、104.58、127.52、158.96；
信息2：回收率试验中浓度进样分析峰面积为73.21；
信息3：标准溶液加入法制备供试品的回收率中浓度进样分析峰面积为105.24；
结果1：以C（μg/ml）为横坐标，A为纵坐标线性回归：y=2.108x+0.334，在线性范围内线性关系良好，用50.10μg/ml对应的峰面积104.58以外标一点法计算回收率为70.0%，不符合要求。
结果2：采用标准溶液加入法计算回收率为100.6%；
讨论：在GC法检查残留溶剂中，因为API的存在很容易发生基质效应，为了避免基质效应带来的测量误差，可以采用标准溶液加入法进行定量。
案例四：HPLC法检测有关物质时应用外标法重复性结果的RSD大于10%。
信息1：供试品在制备过程中经氮吹复溶离心后上清液进样分析，杂质Ⅰ在供试品1、供试品2、供试品3、供试品4、供试品5、供试品6中的峰面积分别为293.224、367.666、313.320、355.254、311.634、288.539；
信息2：对照品溶液浓度5.0212μg/ml，对应的峰面积为360.24；
信息3：在供试品制备中加入内标物S，内标的浓度10.2481，对应的峰面积为354.18；内标和杂质Ⅰ在供试品1、供试品2、供试品3、供试品4、供试品5、供试品6中的峰面积分别为292.712、363.099、303.804、337.099、312.702、283.771和294.234、368.686、312.35、345.154、316.614、289.529；
结果1：外标法计算重复性的RSD为10.2%；
结果2：内标法计算重复性的RSD为0.8%；
讨论：供试品制备过程复杂容易出现含量测不准，在定量方法的选择中外标法存在测量结果不稳定的劣势，此时引入内标物质，以内标法定量可以使测量结果更准确。
三、定量方法的合适应用“场景”
外标法：适用于有杂质对照品，检测器的专属性很强的方法，并且在规定的线性范围内应用。可应用在HPLC-UV法的含量测定、杂质定量检查等方法中。
标准曲线法：适用于浓度范围较大，如50或100倍，需要在高低浓度区域内设置相应的浓度点进行线性回归，供试品的响应值带入标准曲线计算其含量。可应用在离子色谱法、HPLC-ELSD法、包封率测定、溶出曲线的测定、体内药物分析等方法中。
内标法：适用进样及样品制备过程容易引入误差的方法中，可应用在GC中手动进样，供试品的制备过程复杂、微量物质分析等方法中。
标准溶液加入法：适用于基质效应明显的方法中，可应用在GC残留溶剂检查、体内药物分析等方法中。
面积归一化法：适用于非微量物质分析，对检测波长的要求较高，需要供试品中的物质全部出峰。应用于无法获得对照品或者小试研究阶段的杂质分析方法中。
综上所述，在药物研发的分析检测过程中，发生测定结果偏离理论值很远，方法学验证项目不符合要求等情况，研究者在审视方法、仪器、系统误差的同时，需要关注一下是否定量方法的选择是合适的，本人结合工作中的案例浅析了定量方法的选择条件，希望和广大同行共同讨论学习。
参考文献：
《中国药典》2020年版第四部.
2025-06-15
26
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