乳糜泻（CD）是一种常见的胃肠道疾病，患者的小肠会因对麸质的异常免疫反应而发炎受损，目前唯一的治疗方法是终生遵循无麸质饮食，但仍有部分患者即便严格遵循该饮食，肠道损伤依旧持续。此前，虽然已知 CD 与遗传因素密切相关，且涉及多种细胞类型，但免疫-上皮-间质之间的相互作用在肠道损伤中的具体机制尚未完全明晰。

2025年5月6日，牛津大学研究团队，在Nature Immunology上发表了题为“Immune–epithelial–stromal networks define the cellular ecosystem of the small intestine in celiac disease”的研究论文。结合单细胞和空间转录组学，构建了成人和儿童CD患者的肠道免疫细胞、上皮细胞和实质细胞群网络，揭示了其独特的细胞生态系统。阐明了驱动炎症和黏膜重塑的空间局部免疫-实质的相互作用，以及特定疾病相关T细胞亚群占据不同的黏膜微环境，为开发新的治疗策略提供了关键线索。

研究结果

1.CD 中的十二指肠上皮区

对 35 名参与者（21 名 CD 患者和 14 名健康对照）的十二指肠上皮、免疫和间质细胞进行了单细胞 RNA 测序（scRNA - seq），共分析了 86,442 个细胞，并对 20 名参与者进行了空间转录组学分析（图1 ）。

图1 scRNA-seq、RNA-seq、TCR-seq和空间转录组的示意图

分析了数据集1中的EPCAM⁺上皮细胞群。鉴定出9个细胞亚群，代表沿着隐窝-绒毛轴发育进程的祖细胞、分泌细胞和吸收细胞谱系（图2a、b）。在结肠中首次发现的BEST4肠细胞（BEST4⁺ CA7⁺ CPA2⁺ ）表达CFTR并显示氯通道活性（图2b）。还鉴定出Goblet（ITLN1 ⁺ MUC2 ⁺ SPINK4 ⁺）、Tuft（PLCG2⁺ TRPM5⁺ IRAG2⁺）和LYZ ⁺ Paneth 细胞 ( MMP7 ⁺ REG1A ⁺ SOD3 ⁺ PLA2G2A ⁺ )（图2a、b）。在CD中， TA和Enterocytes细胞增多（图2c,d）。

拟时间分析确定了上皮细胞的发育轨迹，从未分化的祖细胞状态向吸收和分泌谱系发展（图2e）。在CD中，EC转移到更早的拟时间状态，成熟EC丢失（图2f）。通过功能基因集分析确定了分泌型 Paneth 样/Brunner 腺细胞 (分泌蛋白和囊泡途径)、BEST4 肠细胞 (氯离子/阴离子通道活性)、丛细胞 (味觉感知) 和肠内分泌细胞 (EEC；肽激素加工/分泌) 的功能。成熟肠细胞表达关键的代谢和常量营养素分解代谢途径，以及主动运输和吸收机制。吸收功能基因仅限于吸收上皮伪时间轨迹末端的细胞状态，与沿隐窝-绒毛轴的 EC 发育一致 (图2g )。总体而言，ACD中的吸收能力降低不仅仅是由于绒毛表面积的减少，还通过缺乏吸收机制的EC祖细胞相对增加，以及成熟肠细胞中的通路下调。

ACD中的EC上调了多种抗原呈递分子，包括经典的HLA I类和II类基因（HLA-DQ除外）以及非经典基因，包括HLA-E和HLA-F（图2h）。干扰素刺激基因（I型和II型）主导上皮反应，包括STAT1（图2h）。在所有EC谱系中均观察到主要的疾病相关反应，包括抗原呈递途径、I/II型干扰素反应、淋巴细胞介导的免疫和细胞毒性以及细胞粘附调节。

图2 CD 中的 EC

2. CD 中肠道 TFH样 CD4 + T 细胞增多

在成人中（数据集 1），CD4+T 主要以 TH1 极化和TH17的效应细胞为主，还有少量幼稚和 FOXP3 +调节细胞群（图3a-c）。有一簇 TFH样细胞表达PDCD1、BTLA、CD28、ICOS和CXCR5。数据集 2（儿科）包含类似的亚群，包括 CCR7+TFH样亚群和表达 PD1、ICOS、CTLA4、BTLA 和 CD161 的 TFH样亚群（图3d，e）。

成人和儿童中的TFH样细胞群表现出与肠道驻留麸质特异性CD4 + T细胞CD12相似的表型特征，并表达TOX2、CD200、IL21和CXCL13。在成人和儿童的ACD中，Treg和TFH样CD4 + T细胞均增加（图3f-i）。CD 相关的 TFH样细胞群显示出较高的CXCL13和IL21，并伴有IFNG和IL21共表达（图3j ,k ），类似于麸质特异性 T 细胞。

图3 CD 中的CD4+T 细胞

3. CD 中的组织驻留记忆 CD8 + T 细胞

肠道 CD8 ⁺ T 细胞表现出相当大的转录异质性，具有多个组织驻留记忆 CD8 ⁺ T (T_RM ) 细胞，包括ITGAE ⁻ IL7R ⁺群体、CCL4 ⁺ CD69 ⁺ ITGAE ⁺群体和两个ITGAE ⁺ T _RM细胞亚群（图4）。CCL4 ⁺和IL7R ⁺群体可能代表 T_RM细胞发育的中间状态。在数据集 2 中观察到了类似的 CD8 ⁺ T 细胞亚群（图4d、e）。

T_RM (2) 和循环细胞群在 ACD 中富集，但 T_RM (1) 细胞不富集（图4f,g）。T_RM (2) 细胞在健康状态下很少见，但在 ACD 中增多，并在 TCD 中持续存在（图4h）。循环 CD8 ⁺ T 细胞增多，形成 ACD 中 2% 至 4% 的细胞（图4i）。由于 T_RM (2) CD8 ⁺ T 细胞在 ACD 中比例增加且增殖，对其进行了深入分析（图5a-e）。T_RM (2) CD8 ⁺ T 细胞表现出 CD103 ⁺组织驻留表型、高GZMA表达和缺失GZMK表达，以及 CXCR6、活化标志物（HLA-DR）和表达共刺激和共抑制分子的基因（TIGIT、TNFRSF9、ENTPD1和LAYN ）的高表达（图4b、c）。ACD 与 TCD 中的 T_RM (2) 细胞比较显示活化标志物表达增加，并且效应功能增强，IFNG、GZMB和IL32表达。

图4 CD 中的CD8 + T 细胞

研究了具有 TCR 组克隆共享的组织驻留簇（T _RM (1)、T _RM (2)、IL7R ⁺和 CCL4 ⁺效应细胞）的拟时间轨迹，以推断假定的分化途径（图5a、b、e）。拟时间轨迹显示两个分支，主要由分支 1 中的 T_RM (1) 细胞和分支 2 中的T_RM (2) 细胞形成，由 IL7R ⁺和 CCL4 ⁺群体发育而来（图5a）。虽然在对照组和 CD 中均观察到分支 1 细胞，但令人惊讶的是，分支 2 几乎完全局限于 ACD 和 TCD（图5b）。此外，分析了 CD8 + T 细胞亚群的细胞因子、趋化因子和 TF 表达。IFNG的主要 CD8 ⁺来源是 CD8 ⁺ T_RM (2) 和循环细胞（图5c、d）。这些群体也表达趋化因子CCL5、CD70和FASLG。天然 IEL（在 ACD 中减少）产生CCL2、CXCL2、CXCL3、IL12、IL18和 I 型干扰素。

CD8 ⁺ T 细胞诱导的上皮损伤被认为是通过 TCR 非依赖性机制介导的。单细胞 TCR检测显示，组织驻留细胞群之间存在预期的克隆重叠（图5e）。几个高频 TRBV 片段（>1% 总克隆）在 CD 中过表达（图5f）。因此，从数据集3中分选出上皮内CD8 ⁺ T细胞，并进行了批量RNA测序。结果显示，一个TRBV片段TRBV28显著富集，该片段在ACD和TCD中富集，但在对照组中不富集（图5g）。TRBV28是TRM (2)群体中CD富集倍数变化最高的高频V片段（图5f）。通过对来自 20 名患有和不患有 CD 的供体的1,068,814 个粘膜 CD8 ⁺ T 细胞进行批量 TCR 组库测序来验证这一点（数据集 4）。同样， TRBV28在 CD 中高度上调，在 ACD 和 TCD 中形成 10% 的独特 CDR3 序列，而在对照组中为 2%（图5h）。

图5 CD 中的CD8 + T 细胞

4.空间转录组揭示CD中的LAs

对十二指肠活检样本进行了空间转录组学分析（图6）。空间转录组显示粘膜内有 13 个不同的转录区域，代表隐窝-绒毛轴的区室（干细胞微环境、下隐窝和中隐窝区和绒毛区）、富含基质细胞的区域、几个固有层区域，其中免疫细胞浸润以浆细胞和淋巴聚集（LAs；图6a、b）为主。在健康状态下，上皮绒毛区室占主导地位；在 ACD 中，这些区室减少（图6c-e）。这些绒毛区域表达吸收功能基因，主要在最成熟的绒毛区室中（图6b）。相反，免疫富集区和 LAs 在 ACD 中大大扩张（图6d、e）。这些区域在空间上是有组织的，LA 与下隐窝和免疫丰富的区域密切相关，而端粒细胞丰富的区域与绒毛结构密切相关（图6g）。

在ACD中，绒毛顶部区域干扰素刺激基因、增殖标志物和IL32表达增加（图6f）。TCR基因、组织驻留标志物（ITGAE、CXCR6、KLRB1）和细胞毒性CD8 ⁺标志物（GZMA、KLRD1、KLRK1）在ACD中增加，表明绒毛中组织驻留的细胞毒性CD8 ⁺ T细胞富集。将空间转录组学与 scRNA-seq 数据相结合，以预测粘膜中的细胞类型。在 ACD 中，TA 细胞特征从隐窝基底扩展到大多数绒毛区域，而成熟的 EC 特征仅限于浅表上皮层。在 ACD 中，LA 显示 TFH样 CD4 ⁺ T 细胞（CXCR5、CXCL13）和 B 细胞（CD19、MS4A1；图6b）特征高度局部富集，浆细胞特征在邻近的免疫丰富区域中扩增。在 ACD 中，CD8 ⁺ TRM (2) 细胞特征在绒毛尖端区域高度富集，与成熟肠细胞共定位（图6h）。

图6 肠粘膜的空间转录组揭示了免疫细胞分布模式

为了进一步研究CD中的LAs，对患有和不患有CD的参与者的十二指肠活检样本进行了进一步的空间转录组学实验（图7）。空间区域分析重现了之前的十二指肠粘膜关键转录区域（图7a、b），其中增生区域富集于隐窝基底部、MUC5AC ⁺和 PGC ⁺上皮、富含浆细胞的免疫富集区以及LAs（图7c-f）。这些LAs在ACD和TCD中均富集。这些固有层LAs毗邻干细胞龛和粘膜肌层（图7g-i），富含TFH样CD4 ⁺ T细胞、Treg细胞和B细胞。浆细胞特征在免疫富集区分布更广泛（图7i-k）。趋化因子和受体基因，包括CXCR5、CCR7、CCL19、CCL21、CXCL13和CXCL14 ，在LAs内特异性富集（图7l），与基质细胞和炎症性肠病中观察到的促炎基质相关的基因也是如此（图7m）。

图7 TFH–B 细胞相互作用在乳糜泻病变的 LA 中高度定位

5. CD中的受体-配体和GWAS候选基因表达

研究团队分析了空间转录组中各区域内趋化因子、细胞因子和肿瘤坏死因子 (TNF) 超家族成员的表达，以及受体-配体共表达（图8a、8b）。信号通路表达具有区域依赖性，表明粘膜信号通路高度局部化（图8a）。在 CD LA中，涉及CXCR5–CXCL13、CCR7–CCL19、CXCR4以及整合素ITGB2和ITGAM 的趋化因子信号通路上调（图8a）。 TNF超家族受体-配体通路在LA中上调，包括TNF、淋巴毒素A和B、CD40、TNFRSF8（CD30）、TNFRSF6B、TNFRSF18（GITR）和TNFRSF4（OX40）。在CD中发现LA富含涉及CXCR4、CXCR5和CXCL13的信号通路（图7l）。数据集 1 中CXCL13、CCR7和ITGB2信号相互作用的单细胞表明，TFH样 CD4 ⁺ T 细胞、B 细胞和髓样细胞相互作用是 LA 中这些信号通路的驱动因素（图8b）。

绒毛尖端区域显示出区域特异性的T细胞和免疫相关途径的激活，包括IL15、IL18、IFNG和IL32表达增加，以及相互作用，包括CXCR6–CXCL16、CCR9–CCL25、DPP4–ADA和HLA-E与KLRC2和KLRD1的相互作用（图8a）。与凋亡途径相关的TNF超家族成员也有高表达，包括FASLG、TNFSF10（TRAIL）、TNFSF11（RANKL）、TNFSF12（TWEAK）和TNFSF13（APRIL）相互作用。单细胞信号通路分析表明CD8 ⁺ T细胞参与趋化因子和II型干扰素信号传导，包括祖细胞EC和循环CD8 ⁺ T细胞之间的CCR9 - CCL25轴相互作用（图8b）。 Wnt信号通路在富含端粒细胞的区域和邻近的绒毛结构中富集（图8a）。

图8 CD 中粘膜免疫反应的空间作用

原文链接：http://www.nature.com/articles/s41590-025-02146-2